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Jul 11, 2023

La structure cristalline d'un domaine de liaison au récepteur du virus mousseux simien fournit des indices sur l'entrée dans les cellules hôtes

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1262 (2023) Citer cet article

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Détails des métriques

La glycoprotéine d'enveloppe de surface (Env) de tous les rétrovirus assure la liaison du virus aux cellules et la fusion des membranes virale et cellulaire. Une relation structure-fonction pour l'Env du VIH qui appartient à la sous-famille des orthorétrovirus a été bien établie. Les informations structurelles sont cependant largement manquantes pour l'Env des virus Foamy (FV), la deuxième sous-famille rétrovirale. Dans ce travail, nous présentons la structure aux rayons X du domaine de liaison au récepteur (RBD) d'un FV Env simien à une résolution de 2,57 Å, révélant deux sous-domaines et un pli sans précédent. Nous avons généré un modèle pour l'organisation des RBD au sein de l'Env trimérique, qui indique que les sous-domaines supérieurs forment une structure en forme de cage au sommet de l'Env, et identifié les résidus K342, R343, R359 et R369 dans le sous-domaine inférieur comme acteurs clés de l'interaction du RBD et des particules virales avec l'héparane sulfate.

Les spumarétrovirus, également connus sous le nom de virus Foamy (FV), sont d'anciens rétrovirus qui ont co-évolué avec des hôtes vertébrés pendant plus de 400 millions d'années1,2. Les FV sont répandus chez les primates non humains, qui peuvent les transmettre aux humains, le plus souvent par des morsures3. Contrairement à leurs parents Orthoretrovirinae mieux étudiés (le VIH étant le membre le plus notable), les FV ont des génomes qui mutent extrêmement lentement et n'induisent pas de pathologies graves malgré leur intégration dans le génome de l'hôte et l'établissement d'infections persistantes à vie4,5. Ces caractéristiques, associées à un large tropisme et à une large gamme d'hôtes6, font des FV des vecteurs candidats attrayants pour la thérapie génique7.

Les protéines de fusion virales entraînent la fusion membranaire par un changement conformationnel, qui peut être déclenché par l'acidification dans un compartiment endosomal et/ou la liaison à un récepteur cellulaire spécifique8,9. Les FV pénètrent dans les cellules par endocytose, la fusion des membranes virale et cellulaire se produisant dans le compartiment endosomal d'une manière sensible au pH, entraînant la libération de la nucléocapside dans le cytosol10. L'exception est le prototype FV (PFV), qui peut également fusionner au niveau de la membrane plasmique11. La glycoprotéine d'enveloppe du FV (Env) appartient à une classe I de fusogènes12, qui sont synthétisés sous forme de précurseurs à chaîne unique qui se replient en trimères, et dont les protomères sont ensuite clivés dans le compartiment de Golgi lors du transport vers la surface cellulaire. FV Env est clivé en deux sites par la furine cellulaire au cours de la maturation, donnant naissance à 3 fragments : le peptide leader (LP), la sous-unité de surface (SU), qui comprend le domaine de liaison au récepteur (RBD), et la sous-unité transmembranaire (TM ), qui abrite les machines de fusion. Les informations structurelles disponibles pour FV Env sont limitées à la tomographie cryo-électronique (TE) des particules virales et à une reconstruction par microscopie cryo-électronique (EM) à 9 Å du PFV Env13, qui a révélé des trimères LP-SU-TM disposés dans des assemblages hexagonaux imbriqués13, 14, avec une architecture différente de celle des trimères Env du VIH15.

L'héparane sulfate (HS) est un facteur d'attachement pour le PFV et le FV16,17 félin, mais les exigences d'un récepteur de surface ou intracellulaire, qui déclencherait la fusion membranaire par le FV Env, restent floues. La recherche d'un récepteur a été compliquée par la liaison du FV au HS, qui est exprimé de manière omniprésente sur les cellules, masquant les candidats récepteurs d'entrée potentiels. Un RBD bipartite, composé de deux régions discontinues de la chaîne polypeptidique, a été identifié en criblant un panel de troncatures SU recombinantes pour se lier aux cellules18. Il a également été démontré que le RBD était la principale cible des anticorps neutralisants chez les humains infectés19,20.

FV Env est fortement glycosylé, avec au moins 13 sites de glycosylation N-liés prédits. Les analyses mutationnelles ont révélé que trois de ces sites N sont essentiels à l'infectivité du PFV - 2 situés dans la sous-unité TM et un dans le RBD. Ce dernier site, appelé site de glycosylation 8 ou N821 est conservé dans la sous-famille FV, et il a été suggéré qu'il joue un rôle direct dans la liaison à un récepteur18 (pour distinguer la nomenclature des sites de glycosylation N-liés prédits (N1 à N15) du symbole à une seule lettre de l'asparagine (N), la première sera soulignée dans tout le texte). Les déterminants moléculaires restants de l'interaction RBD avec les cellules hôtes restent insaisissables, en grande partie en raison d'un manque d'informations structurelles, ce qui a exclu les approches rationnelles de la mutagenèse et des analyses fonctionnelles. Une structure à haute résolution du FV RBD, des informations structurelles concernant l'organisation des RBD dans le trimère Env et la façon dont les RBD contribuent à l'activation Env ne sont pas disponibles.

Dans ce manuscrit, nous présentons la structure aux rayons X du RBD d'un gorille zoonotique FV à une résolution de 2,57 Å, qui révèle un nouveau pli. En amarrant un corps rigide dans la reconstruction cryo-ET disponible d'un trimère PFV Env13, nous avons dérivé un modèle pour l'organisation RBD dans l'Env et identifié les résidus impliqués dans la liaison HS, avec des implications fonctionnelles et évolutives discutées. Les connaissances structurelles sur le FV RBD sont essentielles pour comprendre les interactions virus-cellule, l'étape initiale qui déclenche Env pour médier la fusion membranaire, et pour mieux comprendre la neutralisation médiée par les anticorps par les hôtes humains. Nos données fournissent un cadre pour des études rationnelles de mutagenèse guidée par la structure nécessaires pour discerner la base moléculaire des différentes étapes de l'entrée du FV dans les cellules hôtes.

Des RBD recombinants de plusieurs souches simiennes de FV (SFV) ont été testés pour la production dans des cellules d'insectes Drosophila S2, et seul le RBD du gorille SFV (souche SFVggo_huBAK7422, génotype II ; abrégé en « GII » ici) a été exprimé avec des rendements suffisamment élevés et des cristaux formés . On s'attendait à ce que le RBD soit fortement glycosylé en raison de 8 sites de N-glycosylation prédits (Fig. 1a). Pour augmenter les chances de générer des cristaux bien diffractants, une fraction de la protéine purifiée a été déglycosylée enzymatiquement (RBDD) avec des endoglycosidases H et D, comme décrit dans la section Méthodes. Des cristaux ont été obtenus pour le RBDD, ainsi que pour la protéine non traitée (RBDG). Le RBDD diffractait mieux (2,57 Å) que le RBDG (2,80 Å) et les analyses structurales présentées ci-dessous ont été réalisées en utilisant la structure RBDD, sauf indication contraire. Les statistiques de collecte de données et de détermination de la structure pour les deux formes cristallines sont résumées dans le tableau S1.

a Représentation schématique de l'organisation de la protéine SFV Env indiquant les trois chaînes constitutives : peptide leader (LP), sous-unité de surface (SU) et sous-unité transmembranaire (TM). Les domaines transmembranaires ancrant le LP et le TM dans la membrane sont représentés par des cases noires ; le domaine de liaison au récepteur (RBD) dans SU est mis en évidence dans le spectre bleu-rouge ; le peptide de fusion à l'extrémité N-terminale du TM est représenté en bleu. Les sites de furine entre LP et SU (RIAR126) et SU et TM (RRKR570) sont indiqués par des icônes de ciseaux. La construction d'expression RBD contenait le signal BiP exogène à l'extrémité N-terminale, les résidus 218 à 552 du SFV gorilla GII Env et une double étiquette streptococcique à l'extrémité C-terminale (représentée par deux cercles). La région comprenant les résidus 420 à 426 est dessinée en pointillés car elle n'a pas été vue sur la carte de densité électronique. Les 17 sites de N-glycosylation putatifs pour le SFV Env du gorille sont indiqués par des astérisques et étiquetés N1 à N15, suivant la nomenclature précédemment établie22. b La structure aux rayons X du RBDD est représentée dans un modèle de ruban coloré de l'extrémité N à C-terminale dans le spectre bleu à rouge, respectivement. La ligne pointillée indique la séparation entre les sous-domaines supérieur et inférieur. Les sites de N-glycosylation sont indiqués par N, et les sucres et les chaînes latérales d'asparagine les portant sont affichés sous forme de bâtonnets. La figure a été créée avec Pymol65. c Représentation linéaire du RBD. Les 8 sites de N-glycosylation avec des sucres intégrés à la densité électronique sont représentés par des étoiles grises, y compris le site N10 (N411) qui a montré la densité d'un glucide attaché dans RBDG (molécule B), mais pas dans RBDD. Le site N8 (N390), qui contient une longue fraction sucre partiellement enfouie, est mis en évidence avec un contour plus épais. Les emplacements des six disulfures sont indiqués par des cercles jaunes numérotés comme dans le panneau b. La figure a été créée dans BioRender.com.

Le SFV RBD se replie en deux sous-domaines, chacun avec une topologie α + β, que nous appelons les sous-domaines « inférieurs » (résidus 218–245, 311–369 et 491–524) et « supérieurs » (résidus 246–310 et 370). –490) en référence à leur positionnement par rapport à la membrane virale13 (voir ci-dessous). Le RBD a une forme bilobée en forme de haricot avec la dimension la plus longue de ~ 65 Å. Le sous-domaine supérieur forme un lobe plus large (~ 45 Å de diamètre) et les extrémités N et C un lobe étroit (~ 20 Å de diamètre), également appelé sous-domaine inférieur (Fig. 1b). Le sous-domaine inférieur est composé d'un faisceau de trois hélices (α1, α7, α8) qui se tasse contre un feuillet β antiparallèle et torsadé à quatre brins (β14-β1-β5-β15) et contre l'hélice α2 (résidus 333-346) qui repose perpendiculairement sur le côté du faisceau. Au sein du faisceau hélicoïdal et de la feuille β, les régions proximales aux extrémités N et C sont liées ensemble par des liaisons disulfure (DS) DS1 (C228-C503) et DS2 (C235-C318), respectivement. Le sous-domaine supérieur est formé par deux longues excursions hors du sous-domaine inférieur : ~ 70 résidus reliant les brins β1 et β5, et ~ 130 résidus reliant η4 et β14 (Fig. 2). La chaîne polypeptidique s'étend ainsi deux fois vers le haut et vers l'arrière, formant à l'extrémité les brins externes (β14 et β15) du feuillet β du sous-domaine inférieur. Ces éléments structurels secondaires dans le sous-domaine inférieur englobent un noyau hydrophobe proéminent qui s'étend dans le sous-domaine supérieur, qui a un contenu de structure secondaire inférieur (tableau S2) et est stabilisé par plusieurs réseaux d'interactions polaires (Fig. S1 et Tableau S3). Quatre saillies notables, désignées boucles 1 à 4 (L1-L4) émanent du domaine supérieur : boucle 1 (L1, résidus 253–270, reliant β2 et η1), boucle 2 (L2, résidus 276–281, reliant η1 et β3 ), boucle 3 (L3, résidus 414-436, reliant α5 et β9) et boucle 4 (L4, résidus 446-453, reliant β10 et β11). Les boucles L3 et L4 sont particulièrement mobiles dans nos structures, comme l'indiquent les facteurs B élevés (> 105 Å2) pour leurs atomes Cα (Fig. S2). La densité électronique a été observée pour les 8 sites de N-glycosylation prédits (Fig. 1c), permettant la modélisation d'au moins une N-acétyl glucosamine (NAG) sur chaque site (Fig. 2 et Fig. S3a).

La ligne pointillée horizontale désigne la frontière entre les sous-domaines inférieur et supérieur. Les unités NAG et MAN intégrées uniquement dans la structure RBDG (et non RBDD) sont indiquées par des cadres rouges. La figure a été créée avec BioRender.com.

La recherche dans la banque de données PDB à l'aide de l'algorithme DALI23, avec le RBD et ses sous-structures comme requêtes, n'a donné aucun résultat significatif. Les analyses comparatives avec les structures disponibles des RBD des Orthorétrovirus (Fig. S4) n'ont pas révélé de similitude structurelle, que ce soit au niveau de la topologie de la structure secondaire ou du pli tridimensionnel. Par conséquent, le SFV RBD représente, à notre connaissance, un repli sans précédent.

Il n'y avait pas de différences majeures entre les structures aux rayons X de RBDD et RBDG (leur superposition a donné un écart quadratique moyen (rmsd) inférieur à 1 Å (Fig. S3b, c), à l'exception du nombre différent d'unités de sucre que nous pouvions construire dans les cartes de densité électronique (Fig. S3a). Une caractéristique importante du sous-domaine supérieur est le huitième sucre lié à N (N8) 18 attaché au résidu d'hélice α4 N390. La chaîne latérale N390 et les deux premiers résidus NAG attachés sont enterrés. dans le RBD, rendant le site de clivage EndoH/D inaccessible (Fig. 3b), ce qui a permis de construire 10 résidus de sucre dans le RBDG et 8 dans les cristaux de protéines déglycosylées (Fig. 2 et 3).Le glycane N8 émerge d'une cavité qui a N390 à sa base et s'étend vers le haut, restant en contact avec la protéine et conservant la même conformation dans les deux formes cristallines Les analyses structurales ont révélé que le glycane établit des contacts van der Waal étendus avec les résidus en dessous (surface enfouie de 803 Å2) et forme des liaisons hydrogène avec les atomes de la chaîne principale de Y394 et I484 et la chaîne latérale de E361 (Fig. S5). La fraction glycane recouvre une surface bien conservée et hydrophobe (Fig. 3a, b) et maintient ainsi le pli RBD et empêche l'agrégation, conformément au mauvais repliement rapporté et aux faibles niveaux de PFV SU sécrétée avec une mutation dans le site N818. N8 est le seul site de N-glycosylation dans SU qui est strictement conservé dans la sous-famille FV (Fig. S6), et les résidus de patch hydrophobes qui se trouvent en dessous sont également conservés (Fig. 3c). Ainsi, N8 joue probablement un rôle structurel important dans tous les RBD FV.

a Représentation de surface moléculaire du SFV RBD colorée par l'hydrophobicité des résidus. L'hydrophobicité de chaque résidu a été calculée selon l'échelle de Kyte et Doolittle66 dans Chimera29, la clé de couleur du gradient indiquant l'hydrophobicité la plus faible en bleu, à l'hydrophobicité la plus élevée en jaune. Les sucres aux sites N6, N7, N7' et N9 sont affichés sous forme de bâtonnets blancs, et le sucre attaché à N8 sous forme de bâtonnets cyan. L'entrée montre la liaison clivée par les glycosidases Endo D/H, qui est protégée dans N8. b Le sucre N8 attaché au N390 couvre une région hydrophobe. La région agrandie dans le rectangle en pointillés du panneau a est affichée. Les résidus NAG et MAN sont étiquetés avec des numéros qui correspondent au N-oligosaccharide dessiné dans l'entrée du panneau a. c Le patch hydrophobe recouvert de N8 est bien conservé. La surface SFV RBD est rendue par la conservation des résidus dans Chimera29, en fonction du % de résidus identiques dans les 11 séquences FV Env (alignement illustré à la Fig. S6). Les résidus conservés dans moins de 30 % et plus de 90 % des séquences sont colorés en blanc et violet, respectivement, et les résidus intermédiaires avec un dégradé blanc-violet, comme indiqué sur la clé de couleur sous la représentation de surface.

Pour étudier les différences conformationnelles potentielles entre les RBD de différentes espèces, nous avons utilisé le logiciel AlphaFold 2 (AF2) 24 pour la prédiction ab initio des structures RBD des membres de chacun des 5 genres FV, ​​dont certains existent sous la forme de deux génotypes en raison de la nature modulaire. de FV Env25. Dans chaque FV Env, une région longue d'environ 250 résidus dans le RBD, appelée la variable ou « SUvar », définit deux génotypes co-circulants, I et II, qui ont été trouvés chez les gorilles26, les chimpanzés19 et les mandrills25, entre autres. Les régions SUvar partagent moins de 70% d'identité de séquence d'acides aminés (Fig. S6), tandis que le reste des résidus Env est hautement conservé (> 95% d'identité de séquence). Le SUvar est situé dans le sous-domaine supérieur et englobe les boucles L1-L4 (résidus 282-487 dans GII RBD ; Figs. S6 et S7).

Tous les modèles AF2 générés ont des mesures de haute confiance (Fig. S8) et affichent un pli conservé en accord avec une identité de séquence d'acides aminés> 30%. Des déviations significatives n'ont été trouvées que dans les boucles de la SUvar. Le Template Modeling score (TM-score), qui est, contrairement au rmsd, une mesure de similarité structurelle indépendante de la longueur27 a une valeur moyenne de 0,89 pour les 11 structures comparées. Le modèle AF2 du GII RBD et notre structure déterminée expérimentalement de la même souche se superposent à un score TM de 0,96 et rmsd de 1,5 Å pour 320 des 328 atomes Cα alignés, confirmant la grande précision du modèle AF2. Un « noyau commun » (CC), qui comprend l'ensemble des résidus avec des valeurs de Cα rmsd inférieures à 4 Å pour toutes les superpositions par paires, a été calculé par le serveur Web mTM-align28. Le CC du FV RBD contient 239 des 308 résidus alignés (Fig. S9a), la plupart des résidus CC appartenant aux éléments de structure secondaire formant le sous-domaine inférieur. Les boucles du sous-domaine supérieur ne font en grande partie pas partie du CC (Fig. S9).

Pour étudier l'arrangement RBD dans Env trimérique, nous avons adapté le modèle atomique RBD dans la carte cryo-EM de 9 Å rapportée pour le PFV trimérique (un génotype de chimpanzé I FV) Env exprimé sur des particules de vecteur viral moussant (FVV)13. L'ajustement était justifié par la conservation structurelle élevée entre les RBD de gorille et de chimpanzé, indiquée par un score TM de 0, 88 pour la superposition de la structure GII RBD et du modèle PFV RBD prédit (Fig. S8).

L'ajustement RBD a été effectué avec la fonction fit-in-map dans la suite Chimera29 (Fig. 4a) comme décrit dans le matériel et les méthodes. Le coefficient de corrélation de 0,96 suggère fortement que le RBD exprimé par recombinaison représente sa conformation biologiquement pertinente telle qu'observée à la surface des particules virales. Les 7 glycanes liés à N que nous avons pu résoudre dans la structure RBDD sont tous entièrement exposés au solvant (Fig. 4b), et une densité supplémentaire a été observée dans la carte PFV EM pour les sucres attachés à N5, N6, N7, N8, N9. et N11, validant les placements RBD (le site N7' est absent du PFV Env, et aucune densité supplémentaire n'a été observée sur ce site). Les terminaisons RBD N et C pointent vers la membrane, indiquant que la moitié inférieure de la densité Env est occupée par la sous-unité TM et les résidus SU restants, comme suggéré précédemment13.

a Trois protomères SFV RBDD ont été insérés dans la carte cryo-EM 9 Å (EMBD : 4013) obtenue par reconstruction cryo-EM 3D de l'Env PFV pleine longueur exprimée sur des particules de vecteur viral13. La carte est affichée en surface gris clair et les RBD en mode dessin animé, chaque protomère étant coloré différemment (jaune, blanc, bleu clair). b Les trois RBD, montés comme expliqué dans le panneau a, sont présentés pour illustrer que les hélices α2 et η4, qui portent les résidus de liaison HS (K342, R343, R359, R369), et les glycosylations N-liées (N6, N7 , N7', N8, N9 et N11) pointent vers l'extérieur et sont accessibles aux solvants. La région encadrée sur le panneau de gauche est agrandie et affichée sur le panneau de droite (un seul protomère, coloré en blanc, est représenté à des fins de clarté). c Les vues de l'arrangement RBD trimérique du haut, c'est-à-dire en regardant la membrane (à gauche) et du bas, c'est-à-dire en regardant de la membrane (à droite) sont affichées. Les RBD forment des contacts interprotomères via le L1-L4 dans le domaine supérieur. Les boucles appartenant à chaque protomère sont désignées par L, L' et L". Les images ont été générées dans Chimera29.

Les trois RBD ajustés sont disposés autour d'une cavité centrale à l'apex (région membrane-distale) d'Env (Fig. 4a). Les analyses des surfaces macromoléculaires du modèle RBD trimérique, réalisées dans PDBePISA30, ont révélé une interface interprotomère limitée (<10% de la surface totale accessible au solvant RBD) établie par des boucles L1-L4 qui forment une structure en forme d'anneau au RBD apex, laissant la majeure partie du RBD exposée (Fig. 4b). Selon le modèle, les trois boucles L1 s'engagent probablement dans des interactions homotypiques au centre du RBD, formant un anneau intérieur, tandis que chaque boucle L3 entre en contact avec L4 et L2 d'un protomère voisin. Les résidus à l'interface des modèles ancrés, qui pourraient potentiellement former des contacts non covalents (Fig. S10b, c) et la longueur des régions de boucle (Figs. S9a et S10a) sont mal conservés dans la famille FV. Il est important de noter que les sous-unités PFV Env TM se trimérisent en formant une bobine enroulée centrale proéminente13, une caractéristique de toutes les protéines de fusion de classe I. Ainsi, les interfaces potentielles établies entre les RBD ne seraient que l'un des sites de trimérisation Env contributeurs.

Pour évaluer l'importance des boucles pour la fonction Env, nous avons généré des FVV portant GII Env avec des délétions des boucles L2 et L4 (ΔL2 et ΔL4, respectivement). La quantité de particules de FVV mutantes sécrétées a été réduite de plus de 50 fois (Fig. S11a) et leur liaison aux cellules a été réduite de 2 à 4 fois par rapport aux FVV avec WT Env (Fig. S11a). L'infectivité des deux mutants était cependant inférieure à la limite de détection de notre test (Fig. S11c, d), indiquant que malgré une mauvaise conservation de la séquence, les boucles L2 et L4 jouent un rôle structurel et/ou fonctionnel pertinent pour l'activité d'Env.

Pour localiser les régions potentielles de liaison HS dans le RBD, nous avons étudié la distribution de surface du potentiel électrostatique et identifié une grande surface continue dans le sous-domaine inférieur avec un fort potentiel positif (Fig. 5a). Nous avons ensuite analysé la structure RBD avec le serveur ClusPro qui prédit les sites putatifs de liaison HS en amarrant un tétrasaccharide HS sur la surface de la protéine31. K342 et R343 dans l'hélice α2, R359 dans l'hélice précédente η4 et R369 dans une région de chaîne étendue figuraient parmi les résidus qui avaient le plus grand nombre de contacts avec les modèles HS ancrés à la surface (Fig. 5b, c). Les quatre résidus ont également été cartographiés dans la région chargée positivement dans le sous-domaine inférieur.

a La distribution du potentiel électrostatique a été calculée à l'aide du module Adaptive Poisson-Boltzmann Solver67 dans Pymol65 et tracée sur la surface exclue du solvant du RBD, le rouge correspondant aux potentiels négatifs et le bleu aux potentiels positifs (deux panneaux de gauche). L'ensemble des molécules HS modélisées par ClusPro31 correspond au sous-domaine inférieur et sont affichés en bâtons sur les deux panneaux de droite. Le RBD est montré dans le modèle de dessin animé et dans deux orientations pour illustrer l'emplacement des éléments de structure secondaire de liaison HS prédits. b Nombre prévu de contacts par résidu et par atomes de chaîne latérale calculé par ClusPro et tracé pour chaque résidu RBD, révélant les candidats les plus susceptibles d'être engagés dans la liaison HS. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. c La structure de RBD est montrée dans le dessin animé, avec la région contenant les hélices α2 et η4 surlignées en gris. Le grossissement de la région en boîte grise est montré sur le panneau de droite, avec les éléments de structure secondaire pertinents et les résidus de liaison HS prédits montrés dans des bâtons. Deux liaisons disulfure sont indiquées par des cercles jaunes. La figure a été créée avec Pymol65 et BioRender.com.

Sur la base des prédictions de ClusPro, nous avons produit deux variants GII RBD (K342/R343, appelés « mut1 », et R359/R369, appelés « mut2 ») et testé leur liaison à HS immobilisé sur une matrice Sepharose (Fig. 6a). Les deux variantes RBD éluées au même volume sur la chromatographie d'exclusion de taille compatible avec la taille attendue d'un monomère (Fig. S12), indiquant que les mutations introduites n'ont pas provoqué de mauvais repliement des protéines. Le WT RBD a été retenu sur la colonne d'héparine et élué à une concentration de chlorure de sodium de 300 mM, tandis que les variantes mut1 et mut2 n'ont pas été retenues et éluées dans la fraction d'écoulement. La perte observée de capacité de liaison à l'héparine suggère fortement que les résidus K342, K343, R359 et R369 sont directement impliqués dans les interactions avec HS.

un chromatogramme Héparine-Sepharose du SFV RBD recombinant, WT (rouge) et variantes avec des mutations dans les résidus de liaison HS, mut1 (K342A/R343A) en bleu et mut2 (R356A/R369A) en vert. La ligne pointillée indique la concentration en sel, tracée sur l'axe y de droite. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. b Liaison des ectodomaines recombinants WT RBD et Env aux cellules HT1080. Les niveaux de liaison du SFV RBD et de l'ectodomaine ont été exprimés sous forme de rapport de MFI de la protéine traitée aux cellules non traitées. Pour être comparable avec le RBD, la concentration de l'ectodomaine est calculée et tracée pour la protéine monomère. La stratégie de déclenchement est présentée dans (Fig. S13a). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. c Liaison des ectodomaines Env recombinants WT, mut1 (K342A/R343A) et mut2 (R356A/R369A) aux cellules HT1080 et BHK-21. Le niveau de liaison de SFV Env aux cellules individuelles vivantes a été exprimé sous la forme du rapport de MFI de la protéine traitée aux cellules non traitées (Fig. S13b). La moyenne de deux expériences indépendantes est indiquée. Les niveaux d'expression cellulaire de HS ont été surveillés le jour de chacune des deux expériences (les niveaux de coloration HS étaient de 85, 4 et 61, 6 pour les cellules HT1080, de 8, 40 et de 2, 68 pour les cellules BHK-21 (Fig. S13c)). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. d La liaison des ectodomaines Env recombinants WT, mut1 (K342A / R343A) et mut2 (R356A / R369A) aux cellules HT1080, traitées avec de l'héparinase ou un tampon, a été quantifiée à des concentrations croissantes d'ectodomaines. Le niveau de liaison de l'ectodomaine aux cellules individuelles vivantes a été exprimé sous la forme du rapport de MFI de la protéine traitée aux cellules non traitées (Fig. S13b). Les valeurs moyennes de deux expériences indépendantes sont présentées. L'expression de surface et l'élimination de HS ont été quantifiées par des anticorps spécifiques de HS et ΔHS (Fig. S13d). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. e Cinq lots de FVV portant les Env WT (rouge), mut1 (bleu) et mut2 (vert) ont été produits. Chaque lot est représenté par un seul point ; les lignes noires indiquent les valeurs moyennes. Le pourcentage de particules infectieuses de FVV portant WT, mut1 ou mut2 Env a été calculé comme le rapport entre le nombre de particules infectieuses (déterminé par titrage sur des cellules sensibles, Fig. S14a) et la quantité de particules de vecteur obtenues par RT-qPCR (Fig. S14b). Les FVV mutants ont été comparés aux FVV WT à l'aide du test t apparié bidirectionnel, les valeurs de p étant indiquées sur le graphique. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. f Liaison des FVV portant l'Env WT, mut1 ou mut2 aux cellules HT1080. Trois lots de FVV ont été incubés avec des cellules HT1080 sur de la glace pendant 1 h à différents rapports nombre de particules/cellules, avant de laver et de quantifier les particules de vecteur restantes par RT-qPCR. La ligne pointillée représente le seuil de quantification. Les FVV portant le mutant et les WT Env ont été comparés à l'aide du test t apparié à deux voies, les valeurs de p étant indiquées sur le graphique. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons utilisé la cytométrie en flux pour étudier l'interaction entre le GII RBD et le HS sur les cellules (Fig. S13a). Nous avons constaté que le RBD monomère ne se liait pas aux cellules HT1080, même à des concentrations élevées de protéines (Fig. 6b). Nous avons donc testé une construction plus longue, l'ectodomaine GII Env, qui forme spontanément des trimères, en supposant qu'un oligomère produirait un signal plus élevé en raison des effets d'avidité. L'ectodomaine trimérique lié aux cellules HT1080 (Fig. 6b), de sorte que les mutations K342A/R343A et R356A/R369A (mut1 et mut2, respectivement) ont été introduites dans l'arrière-plan de l'ectodomaine pour les rendre adaptées aux expériences de cytométrie en flux. Nous avons comparé la liaison des ectodomaines Env aux cellules HT1080 et BHK-21 (Fig. 6c), qui sont toutes deux sensibles à l'infection par les FV du gorille. Nous avons quantifié les niveaux d'expression de HS par cytométrie en flux en même temps que les expériences de liaison et vérifié que les cellules BHK-21 exprimaient des niveaux de HS inférieurs à ceux des cellules HT1080, comme cela avait été rapporté 17 (Fig. S13c). Les niveaux d'expression de HS étaient de 10 à 30 fois inférieurs sur les cellules BHK-21 par rapport aux cellules HT1080 (Fig. 6c) et la liaison de l'ectodomaine WT aux cellules BHK-21 était inférieure à celle des cellules HT1080 aux concentrations de protéines les plus élevées testées. Le signal de liaison était dose-dépendant et inférieur d'un log pour les variants d'ectodomaine mut1 et mut2 par rapport à la protéine WT sur les deux lignées cellulaires (Fig. 6c).

Pour prouver que les mutations conçues affectaient spécifiquement l'interaction avec le HS cellulaire, nous avons mesuré la liaison aux cellules HT1080 prétraitées avec de l'héparinase, ce qui a éliminé plus de 90 % du HS des cellules (Fig. S13d). La liaison de l'ectodomaine WT aux cellules traitées à l'héparinase a été réduite d'environ 100 fois par rapport aux cellules traitées au tampon, tandis que les variants mut1 et mut2 ne se sont pas liés, indépendamment du traitement à l'héparinase (Fig. 6d).

L'importance des résidus K342, R343, R356, R369 pour la liaison du virus à HS a été testée en utilisant des FVV qui expriment soit WT, mut1 ou mut2 Env sur leur surface. Le nombre total de particules de FVV libérées par les cellules transfectées, mesuré par RT-qPCR, était environ 6 fois inférieur pour mut1 par rapport aux FVV WT, tandis que mut2 avait la même production de particules que WT (Fig. S14a). Les titres infectieux étaient respectivement 34 et 65 fois inférieurs pour mut1 et mut2, par rapport à WT (Fig. S14b). La proportion de particules infectieuses, le titre infectieux (Fig. S14b), divisé par le nombre total de FVV (Fig. S14a) était de 0,7 % pour les FVV WT Env, tandis que les valeurs pour les FVV mut1 et mut2 étaient de 3 et 22 fois. inférieur, respectivement (Fig. 6e). Nous avons mesuré la liaison des FVV aux cellules par RT-qPCR et avons constaté que la liaison était également réduite de 3 et 23 fois pour les FVV portant respectivement les Env mut1 et mut2, par rapport aux FVV WT Env (Fig. 6f). Ainsi, la liaison aux cellules et les niveaux d'entrée ont été diminués dans la même mesure pour les FVV portant des protéines Env avec des mutations dans le site de liaison HS.

Les résultats décrits pour les protéines Env recombinantes (Fig. 6c, d) et les FVV portant Env pleine longueur (Fig. 6f) concordent avec les données biochimiques (Fig. 6a) et démontrent que les résidus K342, R343, R356, R369 jouent un rôle crucial dans l'interaction du virus avec HS.

Nous avons déterminé la structure aux rayons X du RBD d'un gorille FV, révélant un pli tridimensionnel (Figs. 1 et 2) distinct des structures RBD d'Orthoretrovirus disponibles, c'est-à-dire RBD du virus de la leucémie murine de Friend, virus de la leucémie féline, humain rétrovirus endogène EnvP(b)1 (genre gammarétrovirus)32,33,34 et gp120 du VIH35 (genre lentivirus) (Fig. S4). Cette découverte élargit le répertoire de caractéristiques FV uniques (assemblage, libération de particules36, réplication37) qui ne sont pas partagées avec les Orthoretrovirus, et n'est pas surprenante compte tenu du manque de conservation de la séquence Env entre les sous-familles Orthoretrovirinae et Spumaretrovirinae.

Des informations structurelles sont disponibles pour les RBD de certains orthorétrovirus. Dans le cas des gammarétrovirus, le RBD est relativement petit (∼200 résidus) et se replie en un β-sandwich antiparallèle avec deux boucles étendues qui donnent naissance à un sous-domaine hélicoïdal qui se trouve au-dessus du β-sandwich33 (Fig. S4) . Le sous-domaine hélicoïdal définit le tropisme pour les récepteurs cellulaires38 et montre une grande variabilité de séquence au sein du genre. En revanche, les lentivirus tels que le VIH ont une région de liaison au récepteur qui est plus grande (environ 450 résidus), englobant la majeure partie de la sous-unité SU appelée gp120. Le VIH interagit avec son récepteur apparenté CD4 via gp120, qui est replié en deux sous-domaines, interne et externe, avec la surface de liaison au récepteur formée par des éléments de structure secondaire des deux sous-domaines35. Des boucles variables se projetant hors du noyau gp120 participent à la liaison aux récepteurs, à l'évasion immunitaire39 et sont des acteurs clés de la dynamique conformationnelle Env. Cette Env'respiration' implique différents agencements des sous-unités gp120 et des boucles : la fermée (dans laquelle les boucles forment des contacts), la relâchée (avec un plus grand degré d'ouverture) et l'ouverte (qui est obtenue après la liaison au récepteur CD4)40, 41. En comparant le RBD des Orthorétrovirus à celui des FV, ​​il est possible d'affirmer que l'organisation globale du FV RBD en deux sous-domaines - le bas, qui est mieux conservé, et le haut, qui contient les boucles saillantes et dont la séquence est variable - rappelle des caractéristiques décrites ci-dessus pour les RBD des orthorétrovirus. Il reste à déterminer si la présence de caractéristiques similaires dans les SU Env du VIH et du FV implique une fonction similaire des boucles dans la liaison au récepteur et la flexibilité conformationnelle.

Nous avons adapté la structure RBD déterminée expérimentalement dans la carte à basse résolution (Fig. 4a) obtenue par reconstruction cryo-EM à particule unique de PFV Env trimérique exprimé sur des particules FVV13. Le modèle résultant de l'arrangement trimérique RBD est cohérent avec les données biochimiques et fonctionnelles présentées ici, c'est-à-dire, comme prévu, les résidus de liaison HS (K342, R343, R356, R369) et la carte des glucides liés à 7 N aux surfaces Env qui sont exposées au solvant (Fig. 4c). Selon notre modèle, les boucles L1-L4, situées au sommet du sous-domaine supérieur de chaque protomère, sont à proximité les unes des autres (Fig. 4), laissant, juste en dessous, une cavité bien visible dans le cryo- Cartes EM13. Sur la base de ces observations, nous avons émis l'hypothèse que les interactions interprotomères participent au maintien d'une conformation Env pré-fusion. Nous avons testé des FVV portant des variants Env avec des délétions dans les boucles L2 et L4 (Fig. S11) et montré que ces changements affectaient modestement la liaison du FVV aux cellules, mais entraînaient la perte complète de l'infectivité, corroborant la possibilité que les Env avec des délétions de boucle peut facilement passer à la conformation post-fusion inactive.

Les séquences de boucle sont mal conservées dans la famille FV et ont des longueurs variables (Figs. S9 et S10a). Les superpositions des modèles AF2 de 11 RBD FV ont révélé de légères différences structurelles, limitées à la région variable contenant les boucles (Figs. S8 et S9). Une mauvaise conservation des résidus à l'interface entre les RBD dans l'Env trimérique suggère une faible pression sélective et pourrait indiquer que l'état natif d'Env repose sur différents ensembles de résidus de boucle en interaction dans différents FV. Alternativement, l'interface RBD-RBD pourrait impliquer des interactions polaires entre les atomes de la chaîne principale, bien que nous ne nous attendions pas à ce qu'elles soient nombreuses, étant donné que seule une petite surface du RBD est enterrée à l'interface. L'avantage d'avoir des RBD faiblement liés serait de faciliter la dissociation lors d'un déclencheur de fusion délivré dans l'endosome (pH acide) et/ou par un récepteur cellulaire spécifique. À cet égard, les boucles FV RBD pourraient jouer un rôle équivalent aux boucles V1/V2/V3 dans HIV Env, qui offrent une flexibilité conformationnelle40,41. Il sera également important de discerner les déterminants moléculaires RBD, le cas échéant, qui entraînent la fusion membranaire au niveau de la membrane plasmique, tels qu'utilisés par le PFV, par rapport à tous les autres FV qui fusionnent dans les endosomes11.

Sur la base de la capacité des variants tronqués SU à se lier aux cellules, Duda et al. a défini le RBD de PFV Env comme une région couvrant les résidus 225-55518 (résidus 226–552 dans le gorille GII Env (Fig. S15a)). Dans la région proposée, le segment central s'est avéré indispensable pour l'activité de liaison cellulaire18. Ce segment (appelé également RBDjoin42) englobe les boucles L3 et L4, correspond au sommet de RBD et est fixé par deux liaisons disulfure (Fig. S5 et S15a). Son emplacement, loin des résidus de liaison HS, est cohérent avec la capacité de la troncature PFV SU dépourvue de la région équivalente à se lier aux cellules aux niveaux mesurés pour la protéine WT18. Le modèle AF2 du PFV RBD dépourvu de la région RBDjoin révèle en effet un pli 3D très similaire à celui du RBD complet (Fig. S15b). En revanche, nous montrons que les suppressions des boucles L2 et L4 - dans le contexte du trimère GII Env - ont un effet profond sur l'infectivité, mettant en évidence le comportement différent d'un RBD soluble et des RBD dans le trimère Env pleine longueur.

Nos données démontrent que K342/R343 et R356/R369 sont les principaux résidus de l'interaction RBD avec HS immobilisé sur une matrice inerte ou exprimé sur des cellules (Fig. 6) et que HS est un facteur d'attachement pour le FV du gorille, développant les rapports précédents pour PFV17. Le SFV GII RBD recombinant avec les 4 mutations (K342A, R343A, R356A et R369A) a eu des rendements d'expression très faibles, mais comme prévu, il ne s'est pas lié à la colonne d'héparine. Dans SFV Envs, le résidu en position équivalente à 343 dans le gorille GII Env est toujours une arginine ou une lysine, tandis que l'arginine est strictement conservée en position 356 (Fig. S6). Les résidus aux positions 342 et 369 sont moins conservés parmi les FV Env, bien qu'ils soient généralement entourés de résidus positifs ou polaires. Cela suggère que les R343 et R356 peuvent être importants pour la liaison HS dans tous les FV, ​​tandis que d'autres résidus chargés positivement, spécifiques à chaque virus et situés ailleurs dans le patch avec un potentiel électrostatique positif élevé, pourraient contribuer à la liaison HS dans un virus spécifique. contexte (Fig. 5a).

L'existence d'un récepteur FV avait été proposée par Plochmann et al. car une absence totale de HS n'a pas aboli l'infection par le FV, bien qu'il ait également été proposé que le HS fonctionne comme un véritable récepteur du FV16. La liaison Env résiduelle aux cellules dépourvues de HS, que nous avons observée à la fois pour le WT et les variants altérés de liaison à HS (Fig. 6d), est cohérente avec la présence de récepteurs cellulaires supplémentaires dans l'entrée du FV. Les variants Env défectueux de liaison au HS que nous avons générés seront des outils utiles dans la recherche de récepteurs protéiques potentiels, car ils éliminent la liaison au HS, qui est un facteur d'attachement largement exprimé.

Le coefficient de corrélation élevé que nous avons obtenu pour ajuster la structure des rayons X GII RBD dans la carte PFV Env EM suggère fortement que l'emplacement général des boucles RBD dans notre modèle trimérique est valide. Les résidus de contact et les interactions qu'ils établissent ne peuvent cependant pas être déduits avec précision car nous avons adapté la structure cristalline GII RBD dans une carte cryo-EM obtenue pour un virus différent (PFV) à une faible résolution (9 Å), empêchant le raffinement des chaînes latérales . De plus, toutes les boucles RBD ont des facteurs B élevés (Fig. S2) et 7 résidus n'ont pas pu être construits en L3. Comme AF2 a attribué de faibles valeurs de pLTTD aux résidus dans les boucles d'autres RBD FV, l'identification des résidus de contact à leurs interfaces RBD n'a pas non plus été possible.

Nos données indiquent que les L2 et L4 sont importantes pour l'activité Env en entrée, mais ne fournissent pas de preuves directes pour déduire l'importance de ces régions pour la stabilité et la conformation pré-fusion de l'Env. Comme nous avons effectué l'ajustement dans la carte à basse résolution, nous ne pouvons pas non plus exclure la possibilité que, dans le contexte du trimère Env, les RBD puissent adopter divers degrés d'ouverture, similaires à gp120 dans HIV Env43. L'identification définitive des interfaces RBD au sein de l'Env et de leur rôle dans la stabilisation de la conformation de l'état de pré-fusion nécessitera une structure de résolution atomique du trimère Env pleine longueur. Nous avons essayé de prédire la structure de l'Env pleine longueur trimérique par AF2, mais la tentative n'a pas réussi en raison de la grande taille du protomère Env (près de 1000 résidus) et des limites de calcul du serveur auquel nous avons accès.

Dans ce manuscrit, nous avons décrit la première structure de rayons X d'un FV RBD et validé que le nouveau pli est celui adopté dans le FV Env natif. Nous avons identifié, au sein du RBD, deux sous-domaines en termes de structure, de conservation et de fonction : le sous-domaine supérieur, qui englobe la majeure partie de la région spécifique au génotype, et un sous-domaine inférieur, plus conservé, important pour la liaison au facteur d'attachement HS . Nous avons généré des modèles AF2 pour 10 RBD FV supplémentaires, mettant en évidence sa conformation tridimensionnelle conservée. Ces informations sont essentielles pour comprendre les interactions virus-cellules et ont fourni un cadre pour les études de mutagenèse axée sur la structure nécessaires pour établir la base moléculaire de l'entrée et de la reconnaissance du FV en neutralisant les anticorps comme décrit dans Dynesen et al.42. L'algorithme AlphaFold24 ne peut pas prédire l'arrangement des oligosaccharides à la surface des glycoprotéines. Les observations fonctionnelles précédemment rapportées sur FV Envs, ainsi que le rôle de N8, peuvent maintenant être compris à la lumière de la structure dérivée expérimentalement, soulignant la nécessité de déterminer la structure par des moyens expérimentaux. L'identification des résidus de liaison au HS facilitera la recherche de récepteur(s) FV putatif(s) supplémentaire(s). La compréhension de la relation structure-fonction de l'Env FV métastable, multimérique et fortement glycosylée, ainsi que la découverte de la base moléculaire de l'activation des récepteurs et de la fusion membranaire, nécessiteront des efforts de biologie intégrés et des méthodes structurelles expérimentales.

Un test de cytométrie en flux a été développé par Duda et al. pour détecter la liaison des variants Env du virus Foamy exprimés par recombinaison aux cellules18. En utilisant un panel de troncatures SU fusionnées à la région Fc d'IgG murines (immunoadhésines), les auteurs ont montré que le RBD - défini comme la région minimale du PFV Env suffisante pour se lier aux cellules - englobait les résidus 225 à 555 (correspondant aux résidus 226 à 552 chez le gorille FV RBD (souche GII-K74, numéro d'accession JQ867464)44 (Fig. S6)). Lors de la conception de la construction d'expression pour SFV RBD, nous avons également pris en compte la prédiction secondaire générée par le serveur Web Phyre245. Le résidu I225 se trouvait au milieu d'une hélice putative (résidus 220–230), ce qui nous a conduit à choisir un résidu en amont R218 comme extrémité N-terminale de la construction (Fig. 1a et Fig. S6).

Les informations sur les prédictions de structure secondaire, obtenues par le serveur Web Phyre2, ont également été utilisées pour concevoir la construction d'ectodomaine Env, qui commence après la première hélice transmembranaire prédite (S91) et englobe les résidus jusqu'à I905.

Pour les études structurelles, le RBD (résidus 218-552, souche GII-K74, numéro d'accès Env JQ867464) a été cloné dans un plasmide d'expression de cellules d'insecte pMT/BiP modifié (Invitrogen) désigné pT350, qui contient un promoteur de métallothionéine inductible par cation divalent, le peptide signal BiP à l'extrémité N-terminale (MKLCILLAVVAFVGLSLG) et une étiquette à double streptocoque (DST) (AGWSHPQFEKGGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK) à l'extrémité C-terminale46. Ce plasmide a été co-transfecté dans des cellules de la lignée 2 de Drosophila Schneider (S2) avec le plasmide pCoPuro pour la sélection de la puromycine47. La lignée cellulaire a subi une sélection dans un milieu de cellules d'insectes sans sérum (HyClone, GE Healthcare) contenant 7 μg/ml de puromycine et 1 % de pénicilline/streptomycine. Pour l'étape de production de protéines, les cellules ont été cultivées dans des flacons rotatifs jusqu'à ce que la densité atteigne ~ 1 × 107 cellules / ml, moment auquel l'expression de la protéine a été induite avec 4 μM de CdCl2. Après 6 jours, les cellules ont été séparées par centrifugation, et le surnageant a été concentré et utilisé pour la purification par affinité en utilisant une colonne StrepTactin (IBA). Environ 20 milligrammes de RBD recombinant ont été obtenus par litre de culture cellulaire S2. Le DST a été éliminé en incubant la protéine avec 64 unités de chaîne légère d'entérokinase (BioLabs) dans Tris 10 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 2 mM, pH 8,0, à température ambiante, pendant une nuit. La réaction de protéolyse a été tamponnée dans Tris 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0, et soumise à une autre purification par affinité, récupérant la fraction d'écoulement contenant le RBD non marqué. La protéine a été concentrée et sa déglycosylation enzymatique avec EndoD et EndoH a été effectuée à température ambiante après une nuit d'incubation avec 1000 unités de chaque glycosidase dans 50 mM Na-acétate, 200 mM NaCl, pH 5,5. La protéine a ensuite été purifiée sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique (SEC) Superdex 200 16/60 (Cytiva) dans Tris 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0, concentrée dans des concentrateurs VivaSpin à 8,2 mg/ml et utilisée telle quelle pour des essais de cristallisation. .

Pour les expériences de liaison cellulaire, la construction RBD a été clonée dans un plasmide dérivé de pcDNA3.1(+), pour une expression dans des cellules de mammifères. Le plasmide d'expression a été modifié en insérant une séquence exon-intron-exon du CMV qui augmente l'expression des protéines recombinantes. Le RBD a été cloné en aval du peptide signal CD5 (MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG) avec un site de clivage de l'entérokinase et une étiquette DST dans l'extrémité C-terminale. Les mutants HS ont été générés par mutagenèse dirigée. Les plasmides codant pour les protéines recombinantes ont été transfectés de manière transitoire dans des cellules Expi293FTM (Thermo Fischer) en utilisant le réactif de transfection ADN FectroPRO® (Polyplus), selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 5 jours après quoi les cultures ont été centrifugées. La protéine a été purifiée à partir des surnageants par chromatographie d'affinité en utilisant une colonne StrepTactin (IBA), suivie d'une SEC sur une colonne Superdex 200 10/300 (Cytiva) équilibrée dans Tris 10 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0. Le pic correspondant à la protéine monomère a été concentré et stocké à -80 ° C jusqu'à son utilisation.

L'ectodomaine WT gorilla GII FV a été cloné dans le vecteur pT350 et utilisé comme matrice pour générer les mutants de liaison à l'héparane-sulfate par mutagenèse dirigée. Des cellules de Drosophila S2 ont été transfectées de manière stable avec les vecteurs, comme décrit ci-dessus. L'expression des ectodomaines a suivi les mêmes étapes que celles rapportées pour la production de RBD et après 6 jours, ils ont été purifiés à partir des surnageants cellulaires par chromatographie d'affinité à l'aide d'une colonne StrepTactin (IBA) et SEC sur une colonne Superose 6 10/300 (Cytiva) dans du Tris 10 mM. , NaCl 100 mM, pH 8,0. Les fractions dans le pic correspondant à l'ectodomaine trimérique ont été concentrées dans des concentrateurs VivaSpin et stockées à -80 ° C jusqu'à leur utilisation.

Des essais de cristallisation ont été effectués dans des gouttes assises de 200 nanolitres formées en mélangeant des volumes égaux de la protéine et de la solution réservoir au format de 96 plaques Greiner, à l'aide d'un robot Mosquito. L'apparence et la croissance des cristaux ont été surveillées par un Rock-Imager à la plate-forme centrale de cristallisation des protéines de l'Institut Pasteur à Paris, France48. Le cristal de RBDD natif utilisé pour la collecte de données a été cultivé dans du Tris 0,1 M pH 8,5, formiate de sodium 3,5 M (NaCOOH). Pour les données dérivées, le cristal RBDD, cultivé dans Tris 0,1 M pH 8,5, formiate de sodium 3,25 M, a été trempé pendant une nuit dans la même solution de cristallisation additionnée d'iodure de sodium 0,5 M et directement congelé en utilisant la liqueur mère contenant 33% d'éthylène glycol comme cryo -amortir. Les cristaux de RBDG ont été obtenus à partir d'une solution contenant du tartrate d'ammonium 0,2 M ((NH4) 2 C4H4O6) et 20 % p/v de PEG 3350.

Les données de diffraction des rayons X ont été collectées à la source synchrotron SOLEIL (Saint Aubin, France). Les données natives pour RBDD et RBDG ont été collectées à 100 K sur la ligne de lumière Proxima-149, à une longueur d'onde de 0,9786 Å, tandis que les données dérivées (imbibées d'iode) pour RBDD ont été collectées à Proxima-2A, à une longueur d'onde de 1,907 Å. Les lignes de lumière sont équipées respectivement des détecteurs Pilatus Eiger X 16 M et Eiger X 9 M (Dectris).

Nous avons obtenu des cristaux trigonaux, groupe d'espace 3221 pour le RBDD (2,57 Å), P3121 (plus tard trouvé être P3221) pour le dérivé RBDD (3,2 Å) et des cristaux hexagonaux pour la protéine RBDG (2,8 Å, groupe d'espace P61). Les données de diffraction ont été traitées à l'aide de XDS50 et mises à l'échelle et fusionnées avec AIMLESS51. Le seuil à haute résolution était basé sur l'indicateur statistique CC1/252. Plusieurs applications de la suite CCP4 ont été utilisées tout au long du traitement53. Les statistiques sont présentées dans le tableau S1.

Les phases ont été déterminées expérimentalement par diffraction anormale à une seule longueur d'onde. Le pipeline AutoSol de la suite Phenix54,55 a été utilisé, en utilisant l'ensemble de données anormales, en recherchant des sites d'iode et en spécifiant deux copies NCS dans l'unité asymétrique (ASU). AutoSol a déterminé de manière fiable la sous-structure, composée de 20 sites d'iode. Les phases anormales raffinées ont été utilisées en interne pour mettre en phase la protéine entière à l'aide d'une modification de densité. Le résultat du processus était une structure avec un faible facteur R; de plus, la carte de densité modifiée a montré un bon contraste entre la protéine et le solvant et des caractéristiques hélicoïdales clairement discernables. L'attribution initiale du groupe d'espace des données anormales était provisoire, car l'axe de vis présent dans la cellule permet deux alternatives (P3121 ou P3221). L'ambiguïté énantiomorphe a été résolue après modification de la densité avec les phases anormales et la construction du modèle en regardant la carte et sa qualité. AutoSol a sélectionné sans ambiguïté le groupe d'espace correct, qui est P3221. La structure a été encore améliorée dans Buccaneer56 en mode "phases expérimentales", en utilisant la carte de densité modifiée d'AutoSol et la sous-structure raffinée d'AutoSol. Enfin, le modèle BUCCANEER a été affiné par rapport aux données natives à 2,57 Å par des cycles itératifs de phenix.refine54, BUSTER57,58 et Coot59, qui a été utilisé tout au long de la construction et de l'affinement du modèle pour inspecter et corriger manuellement le modèle.

Pour résoudre la structure du RBDG, la structure RBDD a été utilisée comme modèle de recherche dans Molecular Replacement dans Phaser60 de la suite Phenix. Dans ce cas, l'ASU s'est avéré contenir deux molécules, qui ont été à nouveau raffinées en utilisant une combinaison de BUSTER et de phenix.refine.

Pour les deux modèles, les cartes de différence de densité électronique 2Fo-Fc et Fo-Fc ont été utilisées pour identifier sans ambiguïté les fractions glucidiques et les construire. Pour les deux modèles, la stéréochimie finale a été évaluée par MolProbity (http://molprobity.biochem.duke.edu/)61.

Les cartes finales ont montré une densité électronique claire et interprétable, à l'exception d'une région comprenant les résidus 420 à 426, empêchant la construction sur ces 7 acides aminés et indiquant la flexibilité inhérente de la région. Les modèles atomiques ont été affinés à Rwork/Rfree de 0,21/0,25 et 0,19/0,23, pour les cristaux RBDD et RBDG, respectivement. Les modèles RBDD et RBDG avaient 95,99 % et 95,69 % de résidus dans la région favorisée du tracé de Ramachandran, et 0,31 % et zéro valeur aberrante, respectivement.

L'ajustement RBD a été réalisé avec la fonction fit-in-map dans la suite Chimera29 en utilisant le modèle RBDD (PDB : 8AEZ) et la carte EM 8,8 Å (EMD-4013) obtenue pour le PFV Env13. La carte utilisée pour l'ajustement a été simulée à partir d'atomes à une résolution de 9 Å et des données au-dessus du niveau de contour de la carte 0,025, ce qui donne un coefficient de corrélation de 0,96. Pour préparer la Fig. 4, un niveau de contour de 0,014 a été choisi pour permettre la visualisation de la densité de la plupart des glycanes.

Des cellules de rein de bébé hamster (BHK) -21 (ATCC-CLL-10) ont été cultivées dans du DMEM-glutamax-5% de sérum bovin fœtal (FBS) (PAA Laboratories). Les cellules HT1080 (ECACC 85111505) ont été cultivées dans EMEM-10% FBS additionné de 1x l-glutamine et 1x acides aminés non essentiels (NEAA). Des cellules 293T de rein embryonnaire humain (CRL-3216) ont été cultivées dans du DMEM-glutamax-FBS à 10 %.

Les isolats de virus mousseux ont été nommés selon la taxonomie révisée22 et des noms abrégés ont été utilisés pour les souches de gorille et de chimpanzé19. Le système FVV à quatre composants (plasmides pcoPG, pcoPP, pcoPE, pcu2MD9-BGAL (un plasmide de transfert codant pour la β-galactosidase)) et la construction gorilla Env contenant des séquences de la zoonose GI-D468 (JQ867465) et GII-K74 (JQ867464 ) des gènes env (EnvGI-SUGII) ont été décrits19,42. Brièvement, la construction Env de génotype II que nous avons utilisée (EnvGI-SUGII19) est composée du SU du génotype GII-BAK74, et du LP et TM de la souche GI BAD468, ces deux derniers étant très conservés entre GI et GII.

Des mutations dans le site de liaison au sulfate d'héparane prédit par RBD (K342A/R343A et R356A/R369A) ont été introduites dans ce plasmide Env de gorille contenant l'Env GII pleine longueur. Les variants Env ΔL2 et ΔL4 manquaient respectivement des résidus 278-293 et ​​442-458, qui ont été remplacés par des lieurs glycine (GGGG pour ΔL2 et GG pour ΔL4). Les FVV ont été produits par co-transfection de quatre plasmides (gag:env:pol:transgène β-galactosidase) dans un rapport de 8:2:3:32. Trois microgrammes d'ADN total et 8 μl de polyéthylèneimine (JetPEI, # 101-10N, Polyplus, Ozyme) ont été ajoutés à 0, 5 × 106 cellules HEK 293T ensemencées dans des plaques à 6 puits. Les surnageants ont été collectés 48 h après la transfection, clarifiés à 1500 × g pendant 10 min et stockés sous forme d'aliquotes à usage unique à -80 ° C. L'infectivité du vecteur a été déterminée en transduisant des cellules BHK-21 avec des dilutions en série de cinq fois de vecteurs et en détectant l'expression de la β-galactosidase après 72 h de culture à 37 ° C. Les plaques ont été fixées avec du glutaraldéhyde à 0,5 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 10 min à température ambiante, lavées avec du PBS et colorées avec 150 μl de solution X-gal contenant 2 mM de MgCl2, 10 mM de ferricyanure de potassium, 10 mM de ferrocyanure de potassium et 0,8 mg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-BD-galactopyranoside dans du PBS pendant 3 h à 37 °C. Le comptage a été effectué sur un analyseur UV S6 Ultimate Image (CTL Europe, Bonn, Allemagne), avec une cellule bleue définie comme une unité infectieuse. La transduction cellulaire par le FVV est un substitut de l'infectivité virale et les titres de FVV ont été exprimés en unités infectieuses/ml.

Le rendement des particules de FVV a été estimé par la quantification de l'ARN transgénique associé aux particules. Les ARN de FVV ont été extraits des surnageants de cellules brutes avec le kit d'extraction d'ARN viral QIAamp (Qiagen). Les ARN ont été traités avec un kit sans ADN (Life Technologies), rétro-transcrits avec Maxima H Minus Reverse Transcriptase (Thermo Fischer Scientific) en utilisant des amorces aléatoires (Thermo Fischer Scientific), selon les instructions du fabricant. La qPCR a été réalisée sur l'ADNc à l'aide d'amorces BGAL (BGAL_F 5' AAACTCGCAAGCCGACTGAT 3' et BGAL_R 5' ATATCGCGGCTCATTCGAG 3') avec une étape de dénaturation de 10 min à 95 °C et 40 cycles d'amplification (15 s à 95 °C, 20 s à 60 ° C et 30 s à 72 °C) réalisé avec un Eppendorf realplex2 Mastercycler (Eppendorf). Une courbe standard préparée avec des dilutions en série de plasmide pcu2MD9-BGAL a été utilisée pour déterminer le nombre de copies de FVV. Les résultats ont été exprimés en particules de vecteur/ml, en considérant que chaque particule porte 2 copies du transgène.

Le serveur ClusPro (https://cluspro.org/login.php) a été utilisé pour identifier un site potentiel de liaison à l'héparine31,62,63,64. Le serveur a généré 13 modèles d'un fragment d'héparine tétrasaccharidique entièrement sulfaté amarré au FV RBD et une liste de contacts atome-atome entre la chaîne d'héparine et les résidus protéiques qui a été utilisée pour générer les tracés de la Fig. 5b.

Cent microgrammes de RBD FV recombinants (type sauvage, R356A/R369A, K342A/R343A) ont été injectés à 1 ml/min sur une colonne d'héparine-sépharose (Cytiva) préalablement équilibrée avec un tampon de fonctionnement (10 mM Tris, 100 mM NaCl , pH 8,0). Après lavage, un gradient linéaire (de 0 à 50 % en 30 min) de tampon d'élution (Tris 10 mM, NaCl 2 M, pH 8,0) a été appliqué.

Les cellules adhérentes HT1080 et BHK-21 ont été détachées avec de la trypsine-EDTA et 5 × 105 cellules ont été utilisées par condition. Les étapes de lavage et de coloration des cellules ont été effectuées dans du PBS, 0, 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) à 4 ° C. Les ectodomaines SFV Env ont été ajoutés au culot cellulaire pendant 1 h. Les cellules ont été lavées deux fois, incubées avec l'anticorps StrepMAB-Classic-HRP qui reconnaît l'étiquette streptococcique à l'extrémité C-terminale de l'ectodomaine SFV Env (7,5 µg/ml, IBA Lifesciences #2-1509-001) pendant 1 h, lavées deux fois et incubés avec l'anticorps secondaire couplé au fluorophore AF488 (anti-HRP-AF488 (0,75 µg/ml, Jackson ImmunoResearch, #123-545-021)) pendant 30 min. Les cellules ont été lavées et fixées dans du PBS, 2% PFA à température ambiante pendant 10 min et conservées à 4 ° C jusqu'à l'acquisition. Un minimum de 25 000 cellules ont été acquises sur un cytomètre CytoFLEX (Beckman Coulter). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel Kaluza (Beckman Coulter). Des cellules individuelles viables ont été sélectionnées par l'application séquentielle de portes sur les parcelles de points FSC-A / SSC-A et SSC-A / SSC-H (Fig. S13a). Les cellules marquées avec les deux anticorps secondaires seulement ont été utilisées comme référence. La liaison de SFV Env a été exprimée sous la forme du rapport de l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) des cellules incubées avec les ectodomaines recombinants par rapport aux cellules non traitées (Fig. S13b).

Les cellules ont été traitées avec de la trypsine-EDTA et 5 × 105 cellules ont été marquées par condition. Les cellules ont été lavées une fois avec du PBS, 0,1 % de BSA avant incubation avec 0,1 mUI/ml d'héparinase III de Flavobacterium heparinum (Sigma-Aldrich, #H8891) dans 20 mM de Tris, 0,1 mg/ml de BSA et 4 mM de CaCl2, pH 7,45 pendant 15 min. à 37 °C. L'héparane sulfate a été détecté par coloration avec l'anticorps F58-10E4 (5 µg/ml, AmsBio, UK #370255-S) et les anticorps anti-souris IgM-AF488 (2 µg/ml, Invitrogen #A-21042). Le néoantigène généré par l'élimination de HS (ΔHS) a été détecté avec l'anticorps F69-3G10 (10 µg/ml, AmsBio #370260-S) et les anticorps anti-mIgG-AF647 (4 µg/ml, Invitrogen #A-31571). La coloration et le lavage des cellules ont été effectués dans du PBS, 0,1 % de BSA à 4 °C. Les temps d'incubation étaient de 60 et 30 min pour les anticorps primaires et secondaires, respectivement. L'acquisition du cytomètre et l'analyse des données ont été effectuées comme décrit pour la liaison Env (Fig. S13). Les cellules marquées avec des anticorps secondaires uniquement ont été utilisées comme référence. Les niveaux de coloration HS et ΔHS ont été exprimés en tant que rapport de MFI des cellules marquées aux cellules non marquées (Fig. S13c).

Les cellules HT1080 ont été incubées avec des particules de FVV (1, 10 et 100 particules/cellule) sur de la glace pendant 1 h. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS pour éliminer les FVV non liés et les ARN ont été extraits à l'aide du mini kit RNeasy plus (Qiagen) selon le protocole du fabricant. La RT a été réalisée comme décrit pour la quantification de l'ARN des FVV. Les FVV liés ont été quantifiés par qPCR du gène bgal comme décrit pour le titrage du vecteur ; les cellules ont été quantifiées par une qPCR amplifiant le gène hgapdh avec les amorces suivantes : hGAPDH_F 5' GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 3' et hGAPDH_R 5' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 3'. Les conditions de réaction qPCR étaient les mêmes que celles utilisées pour amplifier le gène bgal. L'expression relative de l'ARNm de bgal par rapport à hgapdh a été calculée à l'aide de la méthode –ΔΔCt et la liaison relative en tant que 2–ΔΔCt.

Les titres infectieux, la concentration de particules, les pourcentages de particules infectieuses et la quantité de FVV liés portant WT et Env mutant ont été comparés à l'aide du test t apparié à deux voies.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données générées dans cette étude et liées aux structures de rayons X déterminées pour le SFV GII RBDD et RBDG ont été déposées dans la banque de données de protéines RCSB sous les codes d'accession PDB 8AEZ et 8AIC, respectivement. Les modèles AF2 des RBD FV ont été déposés dans la base de données Model Archive, avec les codes d'accès suivants : gorilla (génotype II, code d'accès : ma-5hiw1), gorilla (génotype I ; code d'accès : ma-sln9b), prototype du virus Foamy (chimpanzé, génotype I ; code d'accès : ma-ogxjm), chimpanzé occidental (génotype I ; code d'accès : ma-zilao), chimpanzé d'Afrique centrale (génotype II, code d'accès : ma-u3aws), singe vert d'Afrique (code d'accès : ma-mf4i2), orang-outan (code d'accès : ma-kae1t), macaque (code d'accès : ma-eolif), ouistiti (code d'accès : ma-4q50y), bovin (code d'accès : ma-ad22f), équin (code d'accès : ma-iodkg) et félin (code d'accès : ma-ocsub). Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été financé par l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-LABX62-IBEID, Intra-Labex Grant, MB), le 'Programme de recherche transversal de l'Institut Pasteur' (PTR2020-353 ZOOFOAMENV, FB), et financement récurrent de l'Institut Pasteur (FAR, AG). Les agences de financement n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la génération des résultats ou la rédaction du manuscrit. Nous remercions le personnel de la plateforme Utechs Cytométrie & Biomarqueurs et Cristallographie de l'Institut Pasteur, la source synchrotron SOLEIL (Saint-Aubin, France) pour l'accès à l'installation, et le personnel des lignes de lumière Proxima 1 et Proxima 2A pour leur gentillesse et une assistance lors des collectes de données radiographiques. Nous sommes reconnaissants à Jan Hellert, Pablo Guardado-Calvo et Philippe Afonso pour les discussions et les conseils, avec des remerciements particuliers à Max Baker pour la lecture du manuscrit et les corrections en anglais.

Institut Pasteur, Université Paris Cité, CNRS UMR3569, Unité de Virologie Structurale, 75015, Paris, France

Ignatius Fernandez, Riccardo Pederzoli, Delphine Brun, Felix A. King & Marija Backovic

Institut Pasteur, Université Paris Cité, CNRS UMR3569, Unité d’Épidémiologie et Physiopathologie des Virus Oncogènes, 75015, Paris, France

Lasse Toftdal Dynesen, Youna Coquin, Antoine Gessain & Florence Buseyne

Institut Pasteur, Université Paris Cité, Plateforme de cristallographie-C2RT, CNRS UMR 3528, 75015, Paris, France

Ahmed Haouz

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MB et FB ont conçu et supervisé l'étude. IF et LTD ont réalisé l'essentiel des expériences. IF a cristallisé les RBD à l'aide d'AH, collecté les données de diffraction des rayons X, résolu les structures avec RP et effectué les études de liaison avec une colonne d'héparine Sepharose. LTD a réalisé toutes les études de liaison impliquant les cellules. YC a produit et évalué des particules de vecteur de virus Foamy dans des tests d'infection. DB a fourni une assistance technique continue. Le projet de manuscrit original a été rédigé par MB, avec la contribution de IF, RP, LTD et YC, et la révision et l'édition ont été effectuées par MB, IF, LTD, FB et FAR Le financement a été acquis par MB, FB, FAR, et SA

Correspondance avec Marija Backovic.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Wanhong Liu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Fernández, I., Dynesen, LT, Coquin, Y. et al. La structure cristalline d'un domaine de liaison au récepteur du virus mousseux simien fournit des indices sur l'entrée dans les cellules hôtes. Nat Commun 14, 1262 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36923-0

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Reçu : 30 septembre 2022

Accepté : 21 février 2023

Publié: 06 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36923-0

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